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大肠杆菌转化子有大有小原因分析
点击次数:20 发布时间:2020-01-09

     本公司专业经销代理elisa检测试剂盒,进口试剂,近日,我司实验室经常接到客户这样的疑问,他们在测试大肠杆菌转化子时,大肠杆菌转化子有大有小,结果诡异,想咨询一下具体原因。

      这情况我遇到过,尤其菌液PCR时候,有的强有的弱,有的带大小还不一样。我没有具体研究过啥愿意,但把大小一样的那个送去测序,一般都是正确的。


关于你的这个情况,我分析【我自己的我也分析过】
1、可能酶产物碎了一些,这样连进去就有大有小。如果你引物用的是在载体上的,那很可能扩出大小不同的。如果你引物就是在基因上的,这个好解决,你把退火温度逐渐提高,看看是不是那个不同片段就没了。
2、有的时候发生了片段自连【这个看起来好像很可笑,但其实我发现只要末端有一个碱基配对,时间长的话,片段是可以连接到一起的,这个就跟TA连接实际一样】。
3、你的电泳系统有污染,你把别人的片段给收进去了,这个我确实证实过,我一批克隆40个基因,我曾经在别的克隆中挑出过另外的基因。
4、另一种可能,你T载体上连接的方向问题,如果酶切不彻底,可能同样会造成不同大小片段,这些如果你量很多的话其实在跑电泳回收时候是分不开的,但PCR赶巧了,也许就正好扩出来了【这种情况只限于载体上有你用的酶切位点,而你目的片段上恰恰引入了这连个酶,这个你可以试着画个图看看,把TA连接的正反画画】。
5、DH好像能长很大的,也没关系的,我的有时候就很大点,其实不用放室温,你冰箱4-8℃那层放置1个月,就看出来了。
6、所以我觉得这个问题也没法纠结了。如果你觉得切割实在很难,那干脆重新PCR从T载体上扩出来【高保真扩一般也不会突变,当然TAKARA的primerstar除外】,带上酶切位点,然后直接回收酶切连接就可以了,找到重组子后测序正确在表达就行了不是。

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