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原代细胞复苏和传代流程详述
点击次数:97 发布时间:2019-08-08

一、实验前准备工作:
 

1、培养瓶的包被:包被液如多聚赖氨酸(PLL,ScienCell品牌,货号0403或0413)纤维粘连蛋白(BPF,ScienCell品牌,货号8248),以无菌水稀释至2 ug/cm2的浓度包被培养瓶。37度孵箱1小时或4度过夜,从包被好的培养瓶中回收多聚赖氨酸,并用无菌水洗涤培养瓶2遍。包被好的培养瓶不要放置超过24小时,其中的包被液可吸出重复使用2-3次,注意不要污染。


2、完全培养基的配置:以内皮细胞培养基(ECM,ScienCell品牌,货号1001)为例,把配套的胎牛血清(FBS,ScienCell品牌,货号0025)生长因子(ECGS,ScienCell品牌,货号1052)和双抗(P/S,ScienCell品牌,货号0503)加入基础培养液(ECM,ScienCell品牌,货号1001)中。重新贴好标签,并混匀培养基。

二、原代细胞复苏方法:
1、从液氮中取出原代细胞冷冻管,迅速投入37~38 ℃水浴中,其间可以轻轻转动细胞,加快融化速度,大约需要1分钟时间。
2、5分钟内用培养基稀释至原体积的10倍以上,加入培养瓶中,再用1ml培养基洗涤细胞冻存管,保证细胞都被加入培养瓶中,静置于孵箱,12-16小时后更换培养基(除去DMSO)。以后每2天换一次液,保证细胞状态良好。

三、原代细胞传代方法:酶消化法
当细胞生长至70-80%左右可以传代,传代比例以1:2或1:3为佳。具体方法如下:
1、弃去培养瓶中培养基,用PBS洗涤培养瓶2遍,加入0.25%的胰酶消化液(Trypsin-EDTA,ScienCell品牌,货号0103),以消化液能覆盖整个瓶底为准。37度孵育4分钟左右,轻拍培养瓶侧面,显微镜下观察细胞消化情况,直到80%细胞呈现圆形。
2、细胞消化好后,加入胰酶中和液(TNS,ScienCell品牌,货号0113),并轻轻摇动培养瓶,形成细胞悬液,然后将细胞和培养基转移至离心管中,1000rpm离心5分钟。
 

3、弃去上清液,以1-2ml新鲜培养基重新悬浮细胞并吹打均匀,接种于包被好的新培养瓶中,瓶中已有10ml左右的培养基,放入培养箱中培养,每2天更换培养基。


 

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