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原代角质形成细胞的相关分离培养方法
点击次数:34 发布时间:2018-10-29

        原代细胞在相关细胞实验使用过程中越来越多,人们不再单单趋于使用细胞系进行实验研究,因为细胞系常常由于体外长期培养,而容易丢失原有的生物学特性,对药物处理的反应差距越来越大。

        原代细胞刚从组织中分离开,生物学特性未发生很大变化,仍保留原来的遗传特性,也最接近和反应体内生长特性,原代细胞的活力和生长状态都比较好,细胞的纯度和基因保留可达到 90% 以上,适宜用于药物敏感性试验•●、细胞分化等试验研究,使用原代细胞进行实验,可以获得更准确的研究和数据。

         为了更好的服务于广大科研工作者,远慕生物技术人员特提供了角质形成细胞分离的常用方法,技术因人而异仅供参考:

         角质形成细胞是一种不断分化的复层鳞状上皮细胞,其分化的最终阶是形成角蛋白。根据角质形成细胞的发展阶段和特点,从内向外可将其分为五层。基底细胞层又称生发层,棘细胞层,颗粒层,透明层,角质层。

         角质形成细胞的分化成熟表现为从基底层到向角质层的逐渐移行。在单一移行过程中,角质形成;细胞的形状和功能也逐渐发生着变化,从单层柱状上皮的基底层到扁平的细胞核消失的角质层。新生的基底细胞进入棘细胞层,然后上移到颗粒层的最上层。细胞组织来源于实验动物的正常皮肤组织,细胞生长状态为贴壁培养。


 

需要的实验试剂:
1.培养基 1:iCell 原代角质细胞培养体系
4.基础培养基:DMEM/F12
5.缓冲液:无菌不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 1×PBS+1×P/S,pH=7.4
6.消化液 1:1.2U/ml 的 dispase Ⅱ
7.消化液 2:0.25% 胰蛋白酶+0.02mM EDTA
8.消化液 3:0.1%Ⅰ 型胶原酶
9.75% 医用酒精
10.胎牛血清(FBS)

实验器械:
1.培养皿
2.T-25 细胞培养瓶
3.100 目不锈钢网筛
4.200 目不锈钢网筛
5.眼科剪
6.眼科镊
7.离心管(15ml•●、50ml)

实验步骤:
1.新鲜的bao皮组织,装盛于含有无菌生理盐水或 1×PBS 的无菌容器中,于保温盒中,冰上放置离体 6h 内运输到实验室进行后续分离。
2.在无菌环境中取出bao皮组织,用 1×PBS 清洗 2-3 次去除表面血液后,75% 的酒精浸泡 100s
3.酒精浸泡组织后快速将组织转入装有 1×PBS 的培养皿中震荡清洗数次以去除酒精,然后用眼科剪小心剪去皮下组织(脂肪,微血管等)
4.将去除了脂肪和微血管组织的再用 1×PBS 清洗几次后,剪成 3mm*8mm 左右的皮片,用消化液 1  4 度消化过夜(15-18h)。
5.第二天,用 2 个眼科镊子小心撕开过夜消化的皮肤组织,分离真皮和表皮;
6.分离的表皮用眼科剪剪碎后用消化液 3 37 度水浴消化1h。
7.消化完成后用移液器充分吹打 100 次左右,然后用含血清的培养基终止消化,过 200 目不锈钢网筛后取滤悬液,转入 15ml 离心管中,400g 离心 10 分钟,离心完成后弃去上清,沉淀用 3ml 的 1×PBS 吹打重悬后,400g 离心 5min 离心完成后弃去上清,沉淀用 2ml 的原代角质细胞培养基吹打重悬后,转入已经装有 2ml 培养基的 T-25 培养瓶中,将培养瓶置于 37℃ 的二氧化碳培养箱中培养。
8.视细胞贴壁情况 48-72h 后换液去除未贴壁的细胞,之后继续培养,视细胞生长状况和培养基颜色每 2-3d 换液一次;待细胞贴壁率达到 80-90% 后,进行常规传代扩增操作(角质细胞对胰酶不太敏感,消化时间可能会增加到 10-15 分钟,有时需要配合使用无菌细胞刮铲进行传代)。

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